本發(fā)明公開了一種甲氨蝶呤的核酸適配體、核酸適配體衍生物及其應(yīng)用，其核苷酸序列包括序列1?5中所示的DNA分子。核酸適配體可以是各種同源性較高的類似序列或由本發(fā)明序列得到的衍生物。本發(fā)明首次利用核酸適配體HMX38與甲氨蝶呤的特異性結(jié)合作用建立了檢測甲氨蝶呤的方法。本發(fā)明的核酸適配體及其衍生物可用于制備甲氨蝶呤檢測探針、制備藥物載體或者用于藥物設(shè)計與開發(fā)、藥物分離與純化等，具有能夠與甲氨蝶呤高特異性和高親和力結(jié)合、無免疫原性、能夠化學(xué)合成、生物相容性好、分子量小、穩(wěn)定、易于保存等優(yōu)點。