本發(fā)明公開了一種基于同源重組原理的極端嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌無標(biāo)記基因敲除方法,步驟包括初始質(zhì)粒、含有要敲除靶基因上下游同源片段的自殺質(zhì)粒和含酵母核酸內(nèi)切酶I-SceI基因的誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建,自殺質(zhì)粒和誘導(dǎo)質(zhì)粒向嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的接合轉(zhuǎn)移,發(fā)生第一次同源重組單交換子和第二次同源重組雙交換突變株的篩選和鑒定。本發(fā)明首次實現(xiàn)了嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的無標(biāo)記基因敲除,能快速、穩(wěn)定、高效地敲除該菌的基因,不僅可用于該菌基因的功能和代謝機制研究,進(jìn)行遺傳性狀改造,構(gòu)建高效浸礦工程菌;而且獲得的突變株不攜帶任何抗性基因,既可以作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)不同位點的基因敲除和改造,還可以安全用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。