本發(fā)明提供一種ATP檢測試劑及其制備方法和應用，該試劑包括螢火蟲光素、北美螢火蟲光素酶、對碘苯酚、奎諾二甲基丙烯酸酯、PBS、Tris、NP?40、去氧膽酸鈉、吐溫、CHAPS、鹽酸胍、DDT和無菌水。制備方法包括：先將PBS和Tris用無菌水溶解，制成混合緩沖液；將螢火蟲熒光素、北美螢火蟲熒光素酶、對碘苯酚、奎諾二甲基丙烯酸酯、NP?40、去氧膽酸鈉、吐溫?40、CHAPS、鹽酸胍、DDT溶解于混合緩沖液中。本發(fā)明的檢測試劑能完全滿足2D和3D細胞系ATP檢測，并且在3D類器官細胞ATP檢測方面也具有很好的重復性和準確性。此外，本發(fā)明的檢測試劑可以增強化學發(fā)光持續(xù)時間，減少熒光猝滅。