本發(fā)明可二次驗(yàn)證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標(biāo)記物,能夠二次驗(yàn)證同一個(gè)堿基位置的信息,逐個(gè)堿基鑒定未知DNA序列。該技術(shù)過程如下:1)3′端硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進(jìn)行雜交;2)加入第一次延伸反應(yīng)溶液,延伸四種熒光標(biāo)記的核苷酸單體,通過檢測得到堿基信息;3)將2)中延伸上的核苷酸單體用酶進(jìn)行切割清除;4)加入第二次延伸反應(yīng)溶液,延伸熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體,通過檢測再次得到堿基信息;5)用化學(xué)試劑去除4)中延伸上的硫代核苷酸單體上的可脫保護(hù)基團(tuán)和熒光基團(tuán);循環(huán)上述2)、3)、4)和5)所進(jìn)行的過程,直到確定待測DNA中的堿基序列信息。