本發(fā)明涉及一種選育維生素C二步發(fā)酵小菌的增殖方法及應(yīng)用，該增殖方法是將經(jīng)過(guò)物理或者化學(xué)方法處理的小菌稀釋后涂布至平板培養(yǎng)2-3天，用接種環(huán)逐一挑取小菌單菌落，采用劃線法分別涂至分離平板，接種環(huán)挑取大菌均勻接至已涂布小菌的平板中增殖培養(yǎng)2-3天。將增殖后的小菌逐一接斜面，用接種針挑取大菌接至已涂布小菌的斜面中培養(yǎng)，生長(zhǎng)好的斜面菌苔取2環(huán)接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，按10%接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3-4天，檢測(cè)發(fā)酵液古龍酸含量及殘余L-山梨糖濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，選出目的菌株。