一種鹵醇脫鹵酶位點特異性標記多功能探針的方法，屬于酶檢測技術領域，本發(fā)明通過在目標位點引入琥珀突變，然后通過引入與tRNA/RS表達體系完全正交的非天然氨基酸Naek來標記紅外探針，再利用疊氮與炔烴的SPAAC反應將化學熒光染料標記在酶蛋白上，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的位點特異性標記紅外探針和熒光探針。本發(fā)明的操作流程簡單，有效解決了染料標記異質(zhì)性的問題，克服了傳統(tǒng)化學標記的缺陷，本方法所嵌入探針標記的鹵醇脫鹵酶具有較好的酶活力(7.73U/mg)，保持與野生型鹵醇脫鹵酶相當?shù)臒岱€(wěn)定性和最適反應溫度，表現(xiàn)出較高的紅外吸收值(0.017a.u.)和熒光發(fā)射強度(1469a.u.)，并且熒光嵌入效率可以達到49.03％，且酶蛋白在點擊反應過后保留60％以上的活性。本發(fā)明方法在蛋白質(zhì)正交標記中具有廣泛的應用前景。