本發(fā)明屬于核酸分子單堿基錯配的識別領(lǐng)域，公開了一種單分子水平同時區(qū)分單個堿基錯配的方法。單分子水平同時區(qū)分單個堿基錯配的方法包括：結(jié)合納米孔電化學(xué)技術(shù)確定非標(biāo)記的共臂型改良分子信標(biāo)；依據(jù)分子信標(biāo)引起的單個目標(biāo)分子穿孔行為的特征阻斷時間，發(fā)展單分子策略同時區(qū)分完全互補(bǔ)和單堿基錯配的序列。本發(fā)明結(jié)合納米孔電化學(xué)技術(shù)，設(shè)計了一種非標(biāo)記的共臂型改良分子信標(biāo)，其在識別靶序列時表現(xiàn)出較高的信背比(～104)，較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性以及較快的雜化速率。這種免標(biāo)記的單分子策略實(shí)現(xiàn)了在單分子水平同時區(qū)分完全互補(bǔ)和單堿基錯配的序列，本發(fā)明在快速檢測、精準(zhǔn)識別、以及早期臨床診斷等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。