本發(fā)明公開了一種熒光探針及其制備方法與應用，其結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ所示：熒光探針的制備方法，包括如下步驟：將對硝基苯甲醛，2, 5-二甲基吡嗪和催化劑混合得到混合液，將混合液加熱至150-180℃，反應，得到PY-NO2；在PY-NO2中加入多硫化鈉，反應，得到PY-NH2；將PY-NH2、咖啡酸、三乙胺、HOBT和EDC.HCL加入到二氯甲烷和DMF的混合溶劑中得到混合液；所述混合液在惰性氣體的保護下，攪拌，得到雙光子熒光探針的粗產(chǎn)品，純化后，得到雙光子熒光探針純品。本發(fā)明的熒光探針的化學穩(wěn)定性，光物理穩(wěn)定性好；在酸性、中性和堿性中對O2˙-都能響應敏感，測定靈敏度較高，且響應時間極短。