本公開提供了一種在干細胞中進行基因定向敲入的方法，該方法包括如下步驟：S1、將針對待敲入的靶位點的經(jīng)化學修飾的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP復(fù)合物；S2、形成待轉(zhuǎn)染AAV病毒顆粒；S3、將干細胞的懸液與所述RNP復(fù)合物的懸液混合并進行電轉(zhuǎn)，得到電轉(zhuǎn)后的培養(yǎng)物；S4、向所述電轉(zhuǎn)后的物料中加入待轉(zhuǎn)染的AAV病毒顆粒的懸液以進行的轉(zhuǎn)染，得到轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)物；S5、將所述轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)物極限稀釋后進行單克隆化培養(yǎng)，通過PCR及測序并篩選出進行了基因定向敲入的單克隆細胞株。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明建立了一種無需篩選標記，可顯著提高大片段基因敲入干細胞效率的技術(shù)方案。