本發(fā)明涉及一種檢測內(nèi)切酶的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器及其制備與應(yīng)用，包括以下步驟：S01.對玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理；S02.采用循環(huán)伏安法制備金納米-石墨烯修飾的玻碳電極；S03.分別制備濃度為1～10μM的Ru(bpy)32+標(biāo)記的B-DNA信標(biāo)，和濃度為1～10μM的二茂鐵標(biāo)記的C-DNA信標(biāo)；S04.將所述步驟S02所得到金納米-石墨烯修飾的玻碳電極浸入含有巰基修飾的A-DNA中培育3～6h，然后依次浸入步驟S03所得Ru(bpy)32+標(biāo)記的B-DNA信標(biāo)和二茂鐵標(biāo)記的C-DNA信標(biāo)20～40min。可以用來檢測內(nèi)切酶EcoRI和ApaI。本發(fā)明的傳感器具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)、對內(nèi)切酶EcoRI和ApaI具有很高的特異性，不易收到檢測樣品中其他物質(zhì)的干擾；靈敏度極強(qiáng)；而且檢測時(shí)操作簡單方便快速，對抗菌抗病毒藥物的研發(fā)有一定的幫助。