本發(fā)明涉及保護氨基酸與其N端脫掉保護基的雜質(zhì)的分離檢測方法，屬于氨基酸或多肽合成的質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了保護氨基酸與其N端脫掉保護基的雜質(zhì)的分離檢測方法，采用陽離子交換柱分離和柱后茚三酮衍生光度法測定，所述陽離子交換柱為鋰離子交換色譜柱，流動相依次采用緩沖液1、緩沖液2、緩沖液3和緩沖液4進行洗脫。采用本發(fā)明提供的分離檢測方法可以對化學合成多肽起始物料中氨基酸類似物雜質(zhì)進行有效控制，填補了化學合成多肽起始物料對該類雜質(zhì)控制的空白。